金井チーム
肝 liver	肝細胞 hepatocyte 肝幹細胞 hepatic stem cell クッパー細胞 Kupffer cell 類洞内皮細胞 sinusoidal endothelial cell
大腸 large intestine	上行結腸吸収上皮細胞 absorptive epithelial cell of the ascending colon S状結腸吸収上皮細胞 absorptive epithelial cell of the descending colon 直腸吸収上皮細胞 absorptive epithelial cell of the rectum
胃 stomach	表層粘液細胞 surface epithelial cell 腺頚部増殖帯上皮細胞 mucous neck cell 胃底腺細胞 fundic gland
腎 kidney	近位尿細管上皮細胞 proximal tubules 遠位尿細管上皮細胞 distal tubules

白髭チーム
心血管系内皮細胞 cardiovascular system endothelial cell
	肺動脈 pulmonary artery endothelial cell (HPAEC)
	腸骨動脈 iliac artery endothelial cell (HIAEC)
	冠動脈 coronary artery endothelial cell (HCoAEC)
	心臓微小血管内皮 cardiac microvascular endothelial cell (HMVEC-C)
	皮膚微小血管 dermal microvascular endothelial cell (HDMEC)
	皮膚リンパ管微小血管 dermal lymphatic microvascular endothelial cell (LMVC-Ad)
	臍帯静脈 umbilical vein endothelial cell (HUVEC)
	大動脈 Aortic endothelial cell (HAoEC)
	子宮微小血管 uterine microvascular endothelial cell (UtMVEC)
	肺微小血管 lung microvascular endothelial cell (HMVEC-L)
	腓腹筋静脈 sural vein endothelial cell (HSVEC)
	頸動脈 carotid artery endothelial cell (HCeAEC)
	中大脳動脈 middle cerebral artery endothelial cell (HMCA)
	浅側頭動脈 superficial temporal artery endothelial cell (HSTA)
	腕頭動脈 brachiocephalic artery endothelial cell (HBCA)
	鎖骨下動脈 subclavian artery endothelial cell (HSCA)
	※この中から12以上を選択
	※研究協力： ライフラインセルテクノロジー社（Lifeline Cell Technology）、倉敷紡績株式会社（KURABO INDUSTRIES LTD.） 健常ヒト由来の血管内皮細胞の解析においては、上記の企業と連携し、細胞の採取、検体、保存、移動等の研究開発を進めています。

佐々木チーム
胎盤 placenta	細胞性栄養膜細胞（妊娠初期） cytotrophoblast (first trimester) 細胞性栄養膜細胞（満期） cytotrophoblast (term) 合胞体栄養膜細胞（妊娠初期） syncytiotrophoblast (first trimester) 合胞体栄養膜細胞（妊娠中期） syncytiotrophoblast (second trimester) 絨毛外栄養膜細胞（妊娠初期） extravillous trophoblast (first trimester)
子宮 uterus	子宮内膜上皮細胞（増殖期） endometrial epithelial cell (follicular phase) 子宮内膜上皮細胞（分泌期） endometrial epithelial cell (secretory phase) 子宮内膜間質細胞 endometrial stroma cell

　本研究は、我が国の代表研究チームとしてIHECに参加・貢献しようとするものです。IHECは "1000エピゲノム (thousand epigenomes)"すなわち1000細胞系列・人の標準エピゲノムプロファイル決定を目標に掲げ、臓器・細胞系列・性別・年齢・環境要因等によるエピゲノムの多様性を明らかにして、人類共通の研究基盤とすることを目指しています。当IHEC対応型CREST研究チームにおいては、肝細胞・肝幹細胞・クッパー細胞・肝類洞内皮細胞・胃表層粘液細胞・胃腺頚部増殖帯上皮細胞・胃底腺細胞・上行結腸吸収上皮細胞・S状結腸吸収上皮細胞・近位尿細管上皮細胞・遠位尿細管上皮細胞等の標準エピゲノム決定を分担します。我が国においては、胃がん・肝がんの罹患率が高く、私たちは胃がん・肝がん等消化器がん等のエピゲノム異常の研究成果を蓄積しているので、国際競争力のさらなる増強を目指し、消化器等を対象として選択しました。

　2011年5月13日以降国立がん研究センターを受診し、新包括同意体制のもと、ヒトゲノム・遺伝子解析研究に供する可能性についてリサーチ・コンシェルジェから十分な説明を受け、診療後余剰検体の研究利用に対し文書で同意した症例を対象とします。手術材料のうち、国立がん研究センター中央病院病理・臨床検査科スタッフあるいは国立がん研究センター中央病院病理・臨床検査科に併任する研究所スタッフであり、日本病理学会認定病理専門医である臓器担当病理医によって、病理診断に支障を来さない部位から患者に不利益を及ぼさずに研究のために採取された組織を用います (図1)。

図１　試料の採取状況。手術検体が提出されると直ちに、すなわち細胞・核酸が変性する前に、研究者は自ら豊富な試料を繰り返し採取できる。

　本研究は、国立がん研究センター研究倫理審査委員会より承認を得て (課題番号2012-095 「ヒト消化器ならびに泌尿器上皮細胞の標準エピゲノム解析」 研究代表者: 金井 弥栄)、「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」を遵守して実施します。中央病院ゲノム研究個人情報管理室において、連結可能匿名化して解析をすすめます。

　組織検体のコラゲナーゼ消化・蛍光活性セルソーター (FACS: fluorescence-activated cell sorting) 精製により、高品質の純化細胞を調製して、次世代シークエンサを用いて、バイサルファイト変換全ゲノムショットガンシークエンシング・クロマチン免疫沈降シークエンシング (ChIP-seq: Chromatin Immunoprecipitation-sequencing)・非コードRNA解析を施行します。IHEC標準の方法に加え、post–bisulfite adaptor-tagging (PBAT)法等独自の解析手技・アルゴリズムを用い、高品質のデータを産出します。極微量試料におけるエピゲノム解析技術や、5-ヒドロキシメチルシトシンの解析技術の開発も進めます。獲得した標準エピゲノムプロファイルは、IHECの要請に従って、JSTバイオサイエンスデータベースセンター (NBDC: National Bioscience Database Center) 等を介して、試料等提供者個人を全く特定出来ない形で広く公開致します。

　公開されたデータはIHECの成果の一部として、世界の研究者に広く共有され、疾患特異的エピゲノムプロファイルの効率的かつ正確な同定を促進し、疾患研究に大きく貢献することが期待されます。当チーム自体においても、前がん段階にある細胞・がん細胞におけるエピゲノムプロファイルを同様に決定し、標準エピゲノムプロファイルと比較して、がんの診断薬・治療薬創薬標的同定を行います。

図２　手術検体からの肝細胞の純化

図３　手術検体からの大腸吸収上皮細胞の純化

図４　独自に開発したエピゲノムブラウザ

　本研究は、新規エピゲノム解析技術の開発に取り組み、新たなエピゲノムマーカーおよびその標準化解析技術の提案を行うとともに心臓—血管系、特に、血管内皮細胞を対象としたエピゲノム解析を大規模に展開し、データ、技術両面で国際ヒトエピゲノムコンソーシウム（IHEC）に貢献することを目的とします。具体的には、１）新規エピゲノムマーカーの探索（既知のヒストン修飾のうち機能的な意味付けがなされていないものについて、ゲノムワイドな局在情報からその機能を探る）、２）オリゴクローナル抗体取得によるヒストン修飾解析標準化技術の確立、３）微量組織を用いたエピゲノム解析技法の確立(RNA-seqは100細胞、ChIP-seq解析は１万細胞での技術確立を目指す)、４）心血管系内皮細胞（組織12種類、性別含め24種類）のIHECの手順にのっとった大規模解析、を行います（図１）。確立される技術については、エピゲノム解析標準化手法としてIHECに提案を行います。心血管内皮細胞12種のエピゲノムデータについてはデータベースを構築しIHEC参画機関間でデータの共有を行うだけでなく、広くデータを公開し、血管新生、がん研究等の基礎研究のみならず日本人の３大死因の一つである心血管疾患のエピゲノム創薬に役立てます。

図1

　全身に分布する血管系（図2）は、周囲の環境、分布する組織毎に外界からの刺激を受けるばかりか、肺からの距離に応じて変化する酸素分圧、心臓からの距離と分岐の回数に応じて低下する内圧、流速など内部に含む血流からも異なる情報を受けており、心血管系のエピゲノム情報解析はモデル生物では限界があります。特に内皮細胞は血管の最内層を裏打ちするだけでなく、異物からの防御機構、白血球との相互作用、血液粘稠度の調節、血管緊張性の調節、免疫反応、及び新規血管新生などの役割を持っているため、その多様性こそが特徴であり、その刺激応答への破綻が動脈硬化などの疾患発症にいたることが明らかにされています。心血管内皮細胞に関する網羅的なエピゲノム解析は米国プロジェクトにおいて臍帯静脈内皮細胞の解析が進められている以外に前例がなく、より網羅的かつ系統的な解析が待たれています。解析に用いるヒト検体は、純化したヒト初代培養内皮細胞を用いるほか、埼玉医大、循環器病センター等から提供を受ける予定です。

図2

　本研究の実施によりヒト正常血管内皮細胞のエピゲノムマップのデータセットを得ることが出来れば、将来的には疾患細胞のエピゲノム情報との比較により、心血管疾患の分子病態の理解が飛躍的に進むことが期待されるばかりでなく、本研究における技術開発により心血管疾患に対するエピゲノム創薬における標的分子同定を加速化するものと期待されます。

　本研究では、ヒトの胎盤および子宮内膜の細胞を分離・純化し、その標準（正常）エピゲノムを明らかにすることでIHECに貢献します。胎盤と子宮内膜は胎児と母体のインターフェイスを形成しており、生殖発生に不可欠の器官です。これらの器官は胎児の成長に必須であるばかりでなく、習慣流産や不育症、妊娠高血圧症候群（妊娠中毒症）、胞状奇胎、子宮内膜症など様々な疾患と関わっており、その病態の解明には遺伝子発現の研究とともにエピゲノムの研究が必須です。また、これらの研究を推進するため、新たなエピゲノム解析技術の開発にも挑みます。

　これまで私たちはゲノムインプリンティングの分子機構について研究してきましたが、その過程で胎盤のユニークなエピゲノム制御を強く認識するに至りました。例えば、１）マウスのX染色体不活性化は胎盤などの胚体外組織でのみインプリンティングを受けますし（父由来Xが選択的に不活性化される）、２）胎盤特異的なゲノムインプリンティングはDNAメチル化に非依存的であることも分かっています。しかし、そのエピゲノム制御についてはごくわずかしか知られていません。最近、私たちは次世代シークエンサーを用いた研究により、胎盤特異的に母性発現を示すとされていたインプリント遺伝子の多くは母体組織の混入によるアーチファクトに過ぎなかったことを見つけました（Okae et al. Hum. Mol. Genet. 2012）。この結果から、胎盤の細胞を分離・純化して解析する必要性と共に、母体側の子宮内膜もあわせて解析する必要性を強く感じました。また、子宮内膜細胞は閉経後委縮してもホルモン剤投与により脱分化して元に戻ることから、間葉系幹細胞のバイオリソース候補のひとつであり、胎盤の絨毛細胞から放出されたmiRNAを含むエクソソームが母体の細胞に取り込まれるなどの新たな制御の可能性も明らかになってきています。

　本研究では、ヒトの胎盤および子宮内膜の細胞を分離・純化し、その標準（正常）エピゲノムやトランスクリプトームを明らかにし、様々な疾患の研究に資するためのデータ基盤を築きます。具体的には、妊娠初期および満期の胎盤の細胞性栄養膜細胞と合胞体栄養膜細胞、子宮内膜間質細胞、分泌期・増殖期の子宮内膜上皮細胞を分離して解析を行います。また、妊娠高血圧症候群、胞状奇胎、子宮内膜症などの臨床検体のエピゲノムデータを取得し、標準エピゲノムとの比較検討により病態解明への突破口を開きたいと考えています。また、私たちは乏精子症患者の精子においてインプリント遺伝子が高頻度にDNAメチル化異常を示すことを報告し（Kobayashi et al. Hum. Mol. Genet. 2007）、これが体外受精児にインプリンティング異常が多い原因のひとつではないかと推測しました。そこで今回は網羅的なメチローム解析を行ない、インプリント遺伝子以外の領域においてもメチル化変化がないか検討する予定です。

　日本では妊婦のダイエット等により先進国の中で唯一出生体重が低下しており、それが成人後の生活習慣病増加に関係しているのではないかと言われています。また、生殖補助医療が進んだ我国ではすでに全出生児の1/40が体外受精児ですが、それらの児は上記とは逆に出生体重の増加が問題となっており、先天性インプリンティング関連疾患の頻度が高いとの報告もあります。これらの疾患ではエピゲノム異常が強く疑われており、胎盤や子宮内膜のエピゲノムデータは今後これらの異常の原因を解明するためにも役立ちます。私たちは本研究の遂行を通して、エピゲノム研究の推進と世界の人々の健康維持に広く貢献することを目指します。